花椒麻素对肝癌细胞生理功效及机理研究

【摘要】花椒可以药食两用,不仅是实用的中草药,还是倍受人民大众喜欢的重要食用型香料,被誉为中国“八大调味料”之一。花椒及其提取物具有微弱毒性,能对胃癌、肺癌等细胞周期产生阻滞,具有镇痛,止疼等功效,还具有抗氧化,降低人体内脂质含量等广泛、优良的生物学功效,花椒以其天然、低毒、高效而备受关注。花椒麻素是花椒中一类独特的生物活性成分,具有抗炎镇痛、麻醉、杀虫、除皱、调节胃肠道系统等功能,可应用于医药和化妆品行业。但是,目前关于花椒麻素对肝细胞的药用作用及效果的研究深入不够,尤其是作用机制尚不清楚。因此,本研究以HepG2细胞为载体开展了花椒麻素对肝细胞生理功效及机理的探索。研究的内容分为三个部分,主要研究结果如下：1、研究花椒麻素抗氧化功效。采用体外抗氧化实验,检测不同剂量花椒麻素的还原能力,FRAP总抗氧化能力,对羟自由基和DPPH自由基的清除作用；以人肝癌细胞HepG2为实验模型,花椒麻素作用HepG2细胞24h,研究细胞内生理特性下,细胞内SOD活力和MDA含量的变化。结果表明：花椒麻素具有一定的还原力、抗氧化力,呈现浓度剂量关系(p<0.05)；对DPPH、羟自由基的清除率作用稍弱。Fe还原力和FRAP法测得的花椒麻素抗氧化能力的相关性最高(p<0.01),Fe还原力与.OH的相关性最低。随着药物浓度增加,SOD活力是呈先下降随后上升的趋势,差异显著(p<0.05)；花椒麻素浓度达到50μg/mL后,MDA含量开始下降。总体上说明花椒麻素是一类潜在的抗氧化物质,但在清除特异自由基方面能力不强。2、研究花椒麻素抗肿瘤功效,诱导肝癌HepG2细胞凋亡。用MTT法检测不同剂量的花椒麻素对HepG2细胞增殖活性的影响,然后进一步用倒置显微镜、扫描电镜观察细胞形态变化,流式细胞仪(FCM)检测细胞周期变化,DAPI核染、线粒体膜电位变化,单细胞凝胶电泳,RT-PCR以及RT-qPCR检测P53、Caspase-3基因的表达以及Westernblot检测P53nCaspase-3蛋白的表达。结果表明：花椒麻素对HepG2细胞抑制率明显(p<0.05),且抑制作用呈浓度和时间依赖性；100μg/mL花椒麻素作用HepG2细胞后,电子扫描电镜观察到细胞凋亡现象明显；同时FCM的分析结果亦可见细胞出现凋亡峰,产生S期阻滞；呈典型的凋亡彗星尾形状,线粒体膜电位下降；RT-PCR和Westernblot结果表明HepG2细胞内的P53、Caspase-3基因和蛋白的表达均有明显的上调趋势(p<0.05)。花椒麻素引起的形态学上的细胞凋亡是由于相应分子所引起,即控制凋亡的分子通路触发的结果。3、研究花椒麻素降胆固醇生理功效。肝脏是胆固醇代谢的主要器官。选用肝癌HepG2细胞作为研究对象,在高胆固醇模型中探讨不同剂量的花椒麻素对细胞降胆固醇效果的影响,以及胆固醇代谢相关基因表达的作用机理和[Ca2+]i影响效果。以特异性拮抗剂TRPV1拮抗剂和TRPA1拮抗剂)作为干预手段研究TRPV1受体和TRPA1受体在花椒麻素(激动剂)影响机体胆固醇代谢环节中的作用。结果表明：花椒麻素处理24h可呈剂量依赖性地降低HepG2细胞和培养基中的总胆固醇,增加培养基中的总胆汁酸含量,其中20μg/mL的花椒麻素效果较好。花椒麻素降低肝细胞中胆固醇可能的机制是：低剂量的花椒麻素主要通过下调HMG-CoA还原酶的表达,减少肝脏中内源胆固醇的合成；中、高剂量的花椒麻素不仅下调HMG-CoA还原酶的表达,还能上调CYP7A1的表达,促进胆固醇转化为胆汁酸。TRPV1特异性拮抗剂和TRPAl拮抗剂能阻断花椒麻素对胆固醇代谢相关基因表达的影响,故此可推断花椒麻素可能是通过同时激活TRPV1和TRPA1受体调节胆固醇代谢的相关基因。
【作者】周敏；
【导师】刘雄；
【作者基本信息】西南大学，食品科学，2014，硕士
【关键词】花椒麻素；HepG2细胞；抗氧化；凋亡；胆固醇；

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